細胞レベルでの試料への生物学的温度での金属沈着と形態形成

ウシ精子のAl膜コーティングは熱で壊れない

凍結保存されたウシの精液から、特殊なマイクロ流路を用いて良好な状態の精子を分離しました。¹⁶. アミノ基修飾ガラス基板への脱離精子の吸着を確認し、光学顕微鏡を用いて通常のガラス基板への精液との吸着を比較しました（拡張データ図1）。 吸着後、レーザー顕微鏡を使用して精子頭部を直ちに分析したところ、直径は約10μmで、以前の論文のデータと一致していました。¹⁷.

さらに、精子をAl薄膜に堆積させ、レーザー顕微鏡を使用して同様に分析しました。 精子の頭の大きさに大きな変化はなく、鮮明な画像が観察されました。これは、薄いAlの形成が熱変性を引き起こさないことを示しています（図2a）。 この過程の再現性を確認するために、別の精子取り込み用基質を用意し、沈降前後の精子の存在をレーザー顕微鏡で観察しました（拡張データ図2）。 堆積前後で精子の表面形状に変化はなかった。 少なくとも、タンパク質構造は熱変性によって変化せず、沈着が再現可能であることを示しています。 ウシ精子に対する熱の影響を明らかにするために、異なる温度条件下で精子の運動性を比較し、高出力噴霧中の温度上昇を分析しました (図 2b)。 37 °C で 10 分間行った運動性能分析では、表示範囲内のほとんどの精子が活発な鞭毛運動を示しました (拡張データ表 1)。

非破壊熱技術による薄膜形成。 (a) 精子の取り込みと薄膜堆積後のガラス。 高倍率を使用してレーザー顕微鏡検査を行った。 挿入グラフは、先端から首までの精子頭部のサイズを視覚的に分析した結果を示しています。 (B37℃および45℃で10分間インキュベートした後、精子の運動性を分析した。 膜は、関連する結果と一致する温度条件下で堆積され、精子の形状に対する熱変性の影響が観察されました。 (c) 薄膜堆積後の頭から尾までの精子を示す走査型電子顕微鏡画像。 (博士) 精子ガラス要素と精子ガラスの精子頭部の分析。

対照的に、45 °C で 10 分間では、どの精子も鞭毛運動を示さず、尾の熱変性が観察されました。 鞭毛の運動性が活発な精子の形状を維持するために必要な Al の最適沈降温度は 40 °C であることが実証されました。 ガラスの裏面に温度マーク®を付けて成膜しました。 30Wの低RF電力でもプラズマを発生できるカソードは、色温度®を変えずにAl薄膜を成膜。 精子のレーザー顕微鏡画像では、微視的な変化は見られませんでした。

さらに、挿入図に示されている光学的高さ分析結果は、精子の頭部、中央部、尾部のナノスケールの厚さの違いを明確に示しています。 100Wでスプレーすると45℃でガラス裏面のラベルが変色。 基質に吸着した精子は熱変性により表面構造が変化した。 スプレー中の高真空も構造変化に関連していますが、精子の空気乾燥は精子の形状にほとんど影響を与えないことが示されています.¹⁸.

精子の全体像を鮮明に観察できる走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて、Al薄膜サンプルの表面をより詳細に観察しました（図2c）。 精子の中央部と頭部には、表面と首にある微細な突起がはっきりと観察されます。 高度な接着力で精子の表面に堆積することが示された薄膜Alは、分析され、エネルギー分散型X線分光法を使用してAlであることが確認されました（EDS、図2d）。 元素分析から得られたスペクトルは、堆積を示さなかったコーティングされていない基板で実行されたテストとは対照的に、Al の堆積を明確に示しました (拡張データ表 1)。 私たちの研究では、基板は精子吸着プロセス中に親水性表面になるように前処理されたため、接着原子の結合および凝集エネルギーは基板表面の凝集エネルギーよりも弱く、結果は層ごとに異なります。スタッキング。 したがって、精子の界面構造は、スプレー堆積のプロセス中に保存されます。

形状再現・観察用金型製作

バイオミメティック金属ナノモールド (BMNM) は、テープを使用してガラスから Al フィルムを剥がすという簡単な方法を使用して製造されました。 剥離したAl薄膜の表面をレーザー顕微鏡で光学分析したところ、精子と同様に形成されたいくつかのくぼみが明らかになりました（図3a）。 BMNMで観察された精子スパイクは、中央部と尾部の形状が異常なものに焦点を当てて分析されました。

多型解析と人工カビの制御。 (a) テープを使用して基板から薄膜 Al を製造するための剥離方法を示す概略図。 剥離したフィルム表面をレーザー顕微鏡で分析しました（赤いボックス）。 異常に多いミドルカットとテールカット精子の分析。 (B) ジメチルポリシロキサン (ポリジメチルシロキサン、PDMS) を生体模倣金属ナノモールド (BMNM) に流し込み、精子の表面形状を再現しました。 テンプレートから分離された PDMS の表面は、レーザー顕微鏡 (ブラック ボックス) を使用して光学的に分析されました。 異常に多いミドルカットとテールカット精子の分析。 (c) 最初と最後の PDMS ベースの表面。 同じBMNMを使用して5回複製した後、レーザー顕微鏡を使用してBMNMを調べました。 レーザー顕微鏡を使用して、光学ヘッドの表面の高さを分析しました。

光学的高さ分析は、精子の異常な形状が明らかに凹んでいることを示唆しており、沈殿したAl薄膜が高度の精子付着を伴って形成されたことを示しています。 単純な手順を使用したBMNM製造でも、表面形態は高度に保持されました。 対照的に、BMNM 上のマイクロ波のような形状の存在は、剥離に使用されるテープによって引き起こされる問題でした。 この問題には、金属の微視的な厚さを薄膜にコーティングするなど、多くの可能な解決策があります。

ウシ精子の表面の形状は、形状認識能力が高い PDMS を使用してクローン化されました。^19、20. PDMS プリフォーム法は、脱気架橋剤を含む混合物を注ぎ、約 70 °C で 4 時間加熱することによって実行されました。 成形されたPDMSを型から離すと、型と同じ形状の逆精子が表面に観察されました（図3b）。 光学的高さ分析は、精子の形状を模倣する PDMS 上の凸領域を示し、周囲領域の高さ分析は、高さの急激な違いを示しました。 これは、テンプレートの下地であるテープ表面の微細な凹凸が PDMS 表面に影響を与えたためと考えられます。 図は、同じBMNMを使用して5回再現されました（図3c）。 レーザー顕微鏡を用いた PDMS 表面の分析は、精子が 1 番目および 5 番目の PDMS 塩基と同じ形状を有することを示すことに成功しました。 金型表面の形状は、性能評価において高い保存性を示しました。 BMNM の場合、形態形成の 5 回目のラウンドの後、精子の形態が表面にはっきりと観察されました。 この観察結果は、Al 薄膜が PDMS の迅速な形成に必要な 70 ° C で金型を損傷しなかったことを示しています。

さらに、レーザー顕微鏡を使用した各サンプルの同じ精子頭部の高さの分析は、不規則性の特徴において高度の一致を示しました。 Al薄膜を噴霧した後、異なる精子に対して同じ分析を行い、高さの差はPDMSのそれよりもはるかに滑らかでした。 これは、PDMS がフィルター膜と精子表面の接着面を顕微鏡レベルで再現していることを示しています。これは、精子頭部の表面の凹凸パターンが Al 精子ガラスの凹凸パターンと類似していることからです。

精子の詳細な表面構造解析

Alコーティングされた精子の形状は、表面の特徴付けのために原子間力顕微鏡（AFM）を使用して明確に分析されました（図4a）。 精子の頭部に焦点を当てたより詳細な分析では、光学的標高分析の結果と同様に、先端に向かって標高の違いが示されました。 頭部から中央部にかけての高さの増加も、視覚分析の結果と一致していました。 尾に注目することで、レーザー顕微鏡では観察できなかった尾の先端の微細構造を解析することができました。 尾の先端では、ミクロフィブリルが切り離されており、精子の尾が繊維状のチューブリンタンパク質で構成されていたことを示しています。 正常な精子の尾は、9 + 9 + 2 の繊維パターンで構成されていることが知られています。^21、22. このターゲットで観察された繊維の数は確認されていませんが、関連する結果は、露出した微細構造が生物学的温度でのAlの揮発後もその形状を維持していたことを示しています。 AFMは、微生物モニタリング用にすでに確立されています²³; ただし、生体温度は、熱変性による形状変化を考慮する必要がないため、AFMサンプルの長期保存に優れていました。

精子表面のさまざまな構造を分析します。 (a) 薄膜堆積後の頭尾精子の原子間力顕微鏡分析。 白いボックスは、より詳細に分析された領域を示しています。 (B そしてその c) 生体模倣金属ナノモールド (BMNM) に保存された精子の表面形態と、AFM を使用してジメチルポリシロキサン (ポリジメチルシロキサン、PDMS) にクローン化された形状の検査。 黒枠の精子に焦点を当てたレーザー顕微鏡写真。 (博士) AFM 画像標高解析と 3D 標高マッピング。 三角形は精子頭部の微細構造を示しています。 黒 = 先体、黄色 = 赤道セグメント (EqS)、白 = ペンダント、赤 = 中央セグメント。

クローン化されたBMNMおよびPDMSもAFMを使用して分析されました（図4bおよびc）。 同じ精子を、前のセクションで説明したレーザー顕微鏡の視野から分析しました。 BMNMでは、レーザー顕微鏡を使って精子の形状を分析することができました。 これは、露出したチューブリン テールの微細構造によって証明されます。 PDMS精子では、Al精子精子ガラスのように、高解像度の頭から尾までの画像が正常にキャプチャされ、検査されましたが、チューブリンは尾の先端にはっきりと観察されませんでした。 PDMS システムのゴム状の性質により、サブミクロンの柔らかい部分を観察することは困難でした。

AFM画像の3Dマッピング分析により、明確な微細構造が示されました（図4d）。 Ａｌ精子細胞の頭部には赤道部、膜くぼみ、中央部のペンダントが観察され、頭部中央部の隆起が明らかであった。²⁴. これらの構造は、基板に吸着した生精子をAFMを用いて直接観察することですでに確認されています。^25,26. これらの微細構造は、形状を再現した BMNM と PDMS の両方で見つかりました。 これは、BMNMがナノスケールで高い付着力で噴霧することにより、生物学的表面構造を保存していることを証明しています。